一般來說，由于體外診斷(duan)試劑只能檢測可溶(rong)性蛋白質的含量，因此要求樣(yang)本(ben)應(ying)清晰(xi)透明并離心除去沉淀物(wu)或懸浮物質。為確保(bao)(bao)實(shi)驗的(de)準確性(xing)， -20℃或-80℃保(bao)(bao)存的(de)樣本應在(zai)1-6個月內完(wan)成(cheng)檢測，4℃保(bao)(bao)存的(de)樣本在(zai)一周內完(wan)成(cheng)檢測。此外，樣本中不能含(han)有會抑(yi)制HRP活性的NaN3，否則會(hui)造(zao)成假(jia)陰(yin)性結果。

可用于體外診(zhen)斷的樣本一般有血(xue)清、血(xue)漿、尿液、細(xi)胞培養上清以(yi)及組(zu)織勻漿等。不(bu)(bu)同(tong)(tong)樣本類(lei)型的預(yu)(yu)處(chu)理方法(fa)(fa)也不(bu)(bu)同(tong)(tong)。適當的樣本預(yu)(yu)處(chu)理是(shi)確(que)保體外診(zhen)斷結果正確(que)性(xing)和準確(que)性(xing)的第一步。這里，我們(men)將介紹幾種不(bu)(bu)同(tong)(tong)樣本類(lei)型的處(chu)理方法(fa)(fa)。

一、液體樣本

液(ye)體樣本處理原則(ze)：所有的液(ye)體樣本，用無菌管收(shou)集，2-8℃條件(jian)離(li)心20分鐘左(zuo)右（2000-3000轉/分）

1、血清

血清(qing)(qing)是ELISA實驗(yan)最常用(yong)的(de)(de)樣本，其預(yu)處理也(ye)十分(fen)(fen)簡單。使用(yong)無(wu)熱(re)原無(wu)內(nei)毒(du)素的(de)(de)試管或(huo)離(li)心(xin)(xin)管采集(ji)(ji)血液(ye)樣本，將試管或(huo)離(li)心(xin)(xin)管在室內(nei)溫度下放置自然凝固(gu)（視室溫環(huan)境10分(fen)(fen)鐘(zhong)到2小時不(bu)等(deng)）或(huo)4℃過夜，分(fen)(fen)離(li)出(chu)血清(qing)(qing)，（建(jian)議傾斜(xie)試管或(huo)離(li)心(xin)(xin)管以擴大液(ye)面的(de)(de)橫截面，使血清(qing)(qing)能更(geng)大程(cheng)度的(de)(de)分(fen)(fen)離(li)出(chu)來，），2-6℃條件(jian)離(li)心(xin)(xin)20分(fen)(fen)鐘(zhong)左(zuo)右（2000-3000轉/分(fen)(fen)），仔細收(shou)集(ji)(ji)上(shang)清(qing)(qing)，立即進行(xing)測定，建(jian)議在-20℃或(huo)-80℃下將收(shou)集(ji)(ji)的(de)(de)血清(qing)(qing)分(fen)(fen)裝(zhuang)保存，避免反復(fu)凍(dong)融(rong)，保存過程(cheng)中如出(chu)現沉(chen)淀，應(ying)再次離(li)心(xin)(xin)。

注意事項：在收集血液樣本的過程中應避免溶血，因為紅細胞在溶解時會釋放具有過氧化物酶活性的物質，這種情況下，ELISA實驗中將會出現非特異性顯色反應，導致檢測結果不準確，出現假陽性結果。另外，樣本還應避免細菌污染，因為細菌可能含有內源性HRP，也會導致檢測結果不準確。

2、血漿

應根據標本的要求(qiu)選擇(ze)EDTA、肝素鈉(na)、枸櫞(yuan)酸(suan)納或(huo)檸檬(meng)酸(suan)鈉(na)作為抗(kang)凝劑(ji)，使用含抗(kang)凝劑(ji)的采血(xue)管或(huo)離心管采集血(xue)液樣(yang)本，采集后30分(fen)(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)內，混合10-20分(fen)(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)后，2-6℃條件(jian)離心20分(fen)(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)左右（2000-3000轉/分(fen)(fen)(fen)(fen)），仔細(xi)收(shou)集上清(qing)液（血(xue)漿），建議在-20℃或(huo)-80℃下將(jiang)收(shou)集的血(xue)清(qing)分(fen)(fen)(fen)(fen)裝保(bao)存(cun)，避免反(fan)復凍融(rong)。樣(yang)本應(ying)避免溶血(xue)或(huo)高(gao)血(xue)脂。保(bao)存(cun)過程(cheng)中如有(you)沉淀(dian)形成，應(ying)該再(zai)次離心。

注意事項：檢測前請(qing)仔細(xi)閱讀ELISA試劑盒說明書，查看該試劑(ji)盒針對抗凝劑(ji)是(shi)否有特殊要求。

3、尿液

用無(wu)菌管收集(ji)，2-8℃條件離(li)心(xin)(xin)20分(fen)鐘左右（2000-3000轉/分(fen)）。仔細收集(ji)上(shang)清，保(bao)存過(guo)程中如有沉淀形成，應再次離(li)心(xin)(xin)。

4、細胞培養上清

檢測分(fen)泌性的(de)成(cheng)份時，用無菌管收(shou)集。將細胞培養上(shang)清液吸(xi)入(ru)離(li)心管中(zhong)并(bing)以2-8℃條(tiao)件離(li)心20分(fen)鐘左右（2000-3000轉/分(fen)），除去細胞碎(sui)片和雜(za)質(zhi)，收(shou)集上(shang)清液備用，樣本保(bao)存在-20℃或-80℃，避免反復凍融，保(bao)存過程中(zhong)如有(you)沉淀形成(cheng)，應再(zai)次離(li)心。

細胞培養上(shang)清(qing)作(zuo)為樣本，干(gan)擾因素(su)比較(jiao)多，不穩定，一般的(de)雙抗夾心法(fa)有可能檢(jian)測(ce)不出來(lai)，如果經費允許，建議使用定制的(de)競爭(zheng)法(fa)ELISA試劑盒檢(jian)測(ce)細胞上(shang)清(qing)樣本，江萊(lai)生物，好用不貴！

5、腦脊液

用(yong)(yong)(yong)無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左(zuo)右（2000-3000轉/分），仔細收集上(shang)清(qing)，保(bao)存過程中如有(you)沉淀形成(cheng)，應再次離心。（采集大(da)鼠腦(nao)脊液）的(de)方法(fa)：采集腦(nao)脊液時(shi)(shi)，用(yong)(yong)(yong)濕(shi)紗布(bu)擦試大(da)鼠頸背部皮(pi)(pi)膚(fu)，剪去背毛(mao)暴(bao)露皮(pi)(pi)膚(fu)。兩耳連線(xian)剪一橫(heng)切口(1. 5cm左(zuo)右)，在其中點向(xiang)(xiang)尾側沿皮(pi)(pi)下(xia)剪開(kai)2cm，將皮(pi)(pi)分離兩側，擴(kuo)大(da)視(shi)野(ye)。緊貼大(da)鼠頭骨依次逐層剪切各肌(ji)(ji)層，并(bing)斷(duan)端依次拉向(xiang)(xiang)尾側擴(kuo)大(da)視(shi)野(ye)。注(zhu)意，有(you)出血時(shi)(shi)用(yong)(yong)(yong)干紗布(bu)按(an)壓止血，保(bao)持術口清(qing)晰。接近頸后黃韌帶時(shi)(shi)，小心地用(yong)(yong)(yong)7號注(zhu)射針頭分離覆蓋的(de)肌(ji)(ji)肉，暴(bao)露寰枕膜。用(yong)(yong)(yong)1ml注(zhu)射器(針頭用(yong)(yong)(yong)止血鉗使(shi)針尖與針體成(cheng)150度鈍角(jiao))，針斜面向(xiang)(xiang)上(shang)，針尖端近水平刺入蛛網膜下(xia)腔，固定針體，緩慢抽(chou)取(qu)腦(nao)脊液，一般采集量為100-200微升。)

6、唾液

用無菌管收集，2-8℃條件離(li)心(xin)20分鐘(zhong)左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清，保(bao)存(cun)過(guo)程(cheng)中如有沉淀形成，應再次(ci)離(li)心(xin)。

二、固體樣本

固(gu)體(ti)樣(yang)本(ben)處理原(yuan)則：稱(cheng)取(qu)1g的(de)固(gu)體(ti)樣(yang)本(ben)，用(yong)9ml的(de)合(he)適(shi)緩沖液(ye)溶(rong)解，分泌蛋白可以直接離心取(qu)上清(qing)檢測(ce)，細(xi)胞內的(de)蛋白，要先收集細(xi)胞，再用(yong)合(he)適(shi)方法破(po)碎，離心取(qu)上清(qing)測(ce)試。

1、組織標本

切(qie)割標本后，稱取1g組織，加入9ml的pH7.2-7.4左(zuo)右(you)(you)的PBS，用手工或勻(yun)(yun)漿(jiang)(jiang)器(qi)將標本勻(yun)(yun)漿(jiang)(jiang)充(chong)分(fen)(fen)(fen)。離心(xin)20分(fen)(fen)(fen)鐘左(zuo)右(you)(you)（2000-3000轉/分(fen)(fen)(fen)），仔細收(shou)集上清。分(fen)(fen)(fen)裝一份(fen)待檢測，其余冷(leng)凍備(bei)用，保(bao)存過(guo)程(cheng)中(zhong)如有沉淀形成，應再次離心(xin)。對于植物組織，不好勻(yun)(yun)漿(jiang)(jiang)的話，就在液氮中(zhong)充(chong)分(fen)(fen)(fen)研(yan)磨。

2、細胞內蛋白樣本

許多(duo)待測蛋(dan)(dan)白(bai)不是(shi)分(fen)泌(mi)蛋(dan)(dan)白(bai)，而(er)是(shi)存(cun)在于細(xi)胞內的蛋(dan)(dan)白(bai)，這個時候，要(yao)先(xian)收集細(xi)胞，洗(xi)滌干凈，再破碎(sui)細(xi)胞，離心取上清(qing)。

01培養的細胞

A、動物細胞：用PH7.2-7.4的PBS稀釋細胞懸液，使細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融（如果反復凍融，破碎效果不好，就采用超聲波破碎），以使細胞破壞并放出細胞內成份。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

B、植物細胞(bao)：用(yong)(yong)PH7.2-7.4的PBS稀(xi)釋細胞(bao)懸(xuan)液，使細胞(bao)濃度(du)達到100萬/ml左(zuo)右，置于(yu)冰(bing)盒上，用(yong)(yong)超(chao)聲破碎儀(yi)，設置破碎2s，冷卻30s的方式(shi)，充分破碎細胞(bao)，以使細胞(bao)破壞(huai)并放(fang)出細胞(bao)內成份。2-8℃條件離心(xin)20分鐘左(zuo)右（2000-3000轉/分），仔細收集(ji)上清，保存過程(cheng)中如有沉淀形成，應(ying)再次離心(xin)。

02組織的細胞

切割標本(ben)(ben)后，稱取1g組織(zhi)，加(jia)入9ml的(de)(de)pH7.2-7.4左(zuo)右的(de)(de)PBS，用(yong)(yong)手(shou)工(gong)或勻漿器(qi)將標本(ben)(ben)勻漿充分。2-8℃條件離心(xin)(xin)20分鐘(zhong)左(zuo)右（2000-3000轉(zhuan)/分），去除上(shang)清，再(zai)用(yong)(yong)pH7.2-7.4左(zuo)右的(de)(de)PBS小心(xin)(xin)洗(xi)滌沉(chen)淀的(de)(de)細(xi)(xi)胞三遍。再(zai)用(yong)(yong)上(shang)述的(de)(de)細(xi)(xi)胞破碎方法(fa)破碎細(xi)(xi)胞。

細胞反復凍融方法

1） 吸出培養(yang)板中的培養(yang)基(ji)，用胰蛋(dan)白酶(mei)消(xiao)化細胞，然后加入適量的培養(yang)基(ji)將培養(yang)板上的細胞沖洗干凈。懸浮細胞可(ke)以省略該步驟。

2） 將細胞(bao)懸(xuan)浮液收集到(dao)離(li)心管(guan)中，以1000×g離(li)心10分(fen)鐘，然后吸去培養基，用預冷PBS洗滌細胞(bao)3次(ci)。

3） 加入適量的預冷PBS（建(jian)議在(zai)使(shi)用前立即(ji)加入蛋白酶抑制劑）重懸細胞。在(zai)6孔培養板中，每個孔需要150-250μL的PBS來重懸細胞。

4） 使樣本在-20℃或-80℃條(tiao)件和室(shi)溫條(tiao)件下反復(fu)凍融(rong)，重(zhong)復(fu)凍融過程數次，直至細(xi)胞完全裂(lie)解(jie)。也(ye)可以使用超聲波(bo)細(xi)胞破(po)碎(sui)器超聲處理懸浮(fu)液來裂(lie)解(jie)細(xi)胞。

5） 4℃下以10,000×g離心10分鐘，去(qu)除細胞碎片(pian)，收集(ji)上清液， -20℃或-80℃保存(cun)，避免反復凍(dong)融。

3、土壤

稱取(qu)1g土(tu)壤，加入9ml的(de)(de)pH7.2-7.4左(zuo)右的(de)(de)PBS，用手工將標(biao)本充分混勻。2-8℃條件離心(xin)20分鐘左(zuo)右（2000-3000轉/分），仔(zi)細(xi)(xi)收集上清(qing)。分裝一份待檢(jian)測(ce)，其(qi)余冷(leng)凍備用，保存(cun)過程中如有沉(chen)淀(dian)形成，應(ying)再次(ci)離心(xin)。如果是測(ce)分泌蛋(dan)(dan)白，直接取(qu)上清(qing)檢(jian)測(ce)，測(ce)試細(xi)(xi)胞內蛋(dan)(dan)白，要破碎細(xi)(xi)胞。

三、植物樣本

1、標本的精采集及保存

取(qu)(qu)0.1g（誤差±3%以內）新(xin)鮮植物(wu)組織樣本，在(zai)液氮(dan)中充分研磨(mo)；加入1ml的(de)提(ti)取(qu)(qu)液（80%甲醇(chun)）, 置(zhi)于-20℃過夜；于4℃，8000rpm，離(li)心1小時(shi)，取(qu)(qu)上(shang)清。

1） 上清液(ye)過C-18固相萃取(qu)柱(zhu)。具體步驟(zou)是：80%甲(jia)醇（1ml）平衡(heng)柱(zhu)→上樣(yang)→收集(ji)樣(yang)品→移開(kai)樣(yang)品后用100%甲(jia)醇（5ml）洗柱(zhu)→100%乙醚（5ml）洗柱(zhu)→100%甲(jia)醇（5ml）洗柱(zhu)→循環。過柱(zhu)后的樣(yang)本真(zhen)空干燥(zao)或氮氣吹(chui)干，保存備用。

2） 上樣前加入pH7.4 PBS緩(huan)沖液（1ml定容）。混勻后室溫放置30分鐘，然(ran)后4℃離心（8000rpm，15分鐘），取(qu)上清并暫時保存(cun)于4℃待用。

2、植物標本中相關酶或蛋白的測定：（粗提取）

新鮮植物組織請在液(ye)氮中充分(fen)研磨；加入樣(yang)品體(ti)積(ji)9倍(bei)的(de)提取(qu)液(ye)（pH 7.4 PBS緩沖(chong)液(ye)）,請于4℃，8000rpm，離心30分(fen)鐘(zhong)，取(qu)上清并暫(zan)時(shi)保存(cun)于4℃待用。